植物单细胞研究总览，还不来围观？|单细胞专题
近年来，单细胞RNA测序技术在单细胞水平上实现了对异质组织和器官基因表达模式的分析，更好地解决了传统研究中存在的细胞异质性问题，为细胞类型鉴定及罕见细胞类型发现、Maker基因筛选、细胞发育轨迹探讨、细胞功能分析等提供了良好的解决方案，已广泛应用于人类和动物研究。正是由于单细胞测序技术的不断突破，在植物研究中，从单细胞角度，在基因组、转录组和表观组层面研究植物个体细胞功能、分子机制成为可能。
早期的植物单细胞研究主要集中在拟南芥(Arabiopsis Thaliana)的初级根尖。得益于拟南芥具有丰富而详细的空间和时间转录信息，以及组织和发育阶段特异的标记基因，因此该模式物种进行单细胞数据分析具有天然的优势。此外，植物根很适合用于描绘发育转变，因为它具有严格的时空分布，相同类型细胞围绕中心柱排列成同心圆，研究者可以沿着纵轴捕捉根的发育状态。这些研究表明，scRNA-Seq在检测细胞类型/状态和解决复杂组织中的发育轨迹方面具有很大的潜力。
随后的研究逐渐多样化，单细胞技术应用于拟南芥、玉米(Zea Mays)、水稻(Oryza Sativa)和番茄(Solanum Lycopersicum)等物种的气孔、叶片维管系统、茎尖、花序和侧根的图谱和发育研究(下图)。这些早期的研究为分化过程、应激反应和细胞周期动态变化等方面提供了独特的见解。
植物单细胞转录组研究进展（Ryu KH, et al. 2021）
虽然这些早期研究激发了科研人员对将scRNA-Seq应用于植物的遐想，但这项技术也突显了实验设计和数据分析的挑战。其中主要的问题是如何保证解离的植物细胞的可用性，如何处理细胞解离过程中产生的背景干扰，如何去降低或去除这种背景下的生物/非生物应激反应，以及如何识别“cluster" 对应的完整细胞信息。这些问题将会随着单细胞技术的发展和在植物领域应用经验的积累逐步得到解答！
以往植物转录组学研究通常是将植物整个器官或组织均质化后测序，因此每个细胞对转录丰度的贡献变得不可识别。这种方法虽然有助于在器官或组织水平上解决许多生物学问题，但是无法了解发生在罕见细胞类型或单个细胞中的转录过程。在单细胞测序技术出现之前，在植物中一般使用三种不同的方法来进行单个细胞的转录分析：流式分选（FACS）、单个细胞类型中分离标记的细胞核（INTACT）和激光捕获显微切割（LCM）。流式分选前，需要植物样本先制备成原生质体然后荧光标记不同细胞类型。INTACT技术需要转基因标记特定细胞类型的细胞核，通过免疫纯化获取特定标记的细胞核，可以避免分离和机械纯化整个细胞的需要。激光捕获显微切割则是根据细胞的形态特征切除特定类型的细胞。然而，FACS和INTACT这两种技术都只能应用于容易转化的植物，从而限制了它们在其他植物物种中的应用。虽然激光捕获显微切割可以应用于更广泛的植物物种，但LCM 和FASC一样，样本处理条件比较苛刻，需要高度复杂和昂贵的设备，只能获得低于最佳产量和浓度的目标细胞。
虽然近年来利用原生质体分离技术（PI, protoplast isolation）进行植物单细胞转录组测序的研究已经有了较大进展，但与哺乳动物组织和细胞相比，植物组织和植物细胞开展单细胞测序仍具有更高的挑战：
植物细胞被固定在刚性细胞壁基质中，分离单细胞时需要将其移除；
植物细胞壁的酶消化是一种重要的胁迫源，容易刺激植物细胞出现应激反应，诱导压力应答基因的表达，人为引入转录偏差；
植物原生质体大小存在可变性（渗透压导致的原生质体胀大）；
质体细胞器、和液泡中存在可与RNA相互作用的次级代谢物；
不同组织类型间适用的酶组合不同，需要优化消化细胞壁所需的酶；
制备的原生质体很脆弱，活性波动大。
在动物研究中，由于某些样本类型中细胞较大或者细胞对酶解离敏感，往往会采用单细胞核测序（snRNA-seq），因此植物开展单细胞核测序（PN-seq，plant-nuclei sequencing），也是一个比较好选择，以克服上述困难。
目前植物单细胞转录组研究主要分为两类：一类是对原生质体进行RNA测序，另一类是对植物细胞核进行测序。
对原生质体的测序目前主要是基于10X Genomics的Chromium平台，其原理是通过控制微流体的进入，将带有引物序列的凝胶珠与单细胞、酶混合，形成一个GEM ( Gel in Emulsion )的液滴结构，实现单细胞的分离。基于原生质体的单细胞转录组测序已经定义了来自各种植物器官和组织的成千上万个单独细胞的转录组，这些结果表明细胞存在明显的转录异质性。但scRNA-seq也存在一些显著的局限性，例如转录本检出率低（小于20%）、降解细胞壁会引起15%-20%的基因表达发生变化（即获得的转录本与体内真实状态不一致）。
对植物细胞核进行测序的sNucRNA-seq可以获得更真实的细胞类型信息，且不用担心细胞大小波动大的问题。对拟南芥根组织进行的sNucRNA-seq研究表明，与scRNA-seq相比，sNucRNA-seq可以定义出新的细胞类型。此外，进行sNucRNA-seq分析可以更容易地捕获和评估转录异构体以及可变剪切信息。后续sNucRNA-seq研究中，一个重要的目标是优化细胞核分离，以减少转录信息的遗漏及RNA的降解。
整体上看植物单细胞研究还是以图谱类为主，其次是发育图谱研究，机制类文章还是很少。另外植物单细胞研究目前研究的物种极为有限，大部分文章的研究对象是植物研究的模式物种拟南芥、玉米和水稻。结合目前植物单细胞研究现状和其他领域的单细胞研究思路，对于后续的植物单细胞研究，建议可以从以下角度开展：
1、大细胞量图谱类研究：此处说的大细胞量，既可以是同一组织细胞量的增加，也可以是不同组织（目前的植物单细胞研究以根为主，后续研究可以拓展到其他器官）细胞量的累加。前者可以提高特定组织器官细胞构成分析的精细度，发现新的稀有细胞，后者能打破目前植物单细胞研究组织类型单一的现状，对植物单细胞研究具有一定推动意义。
2、深层次的数据挖掘：在同样做细胞图谱的前提下，增加数据挖掘深度是提高文章档次的有效方式。例如植物研究中生长发育、胁迫等是主要的研究方向，二者会影响不同细胞类型的构成比例变化，其深层次的原因是细胞状态发生转变，有效利用拟时序分析，挖掘细胞分化路径、发现新的细胞亚型，可以为文章增色不少。现有单细胞文献中，主要通过拟时序分析鉴定发现QC 细胞，仅在2019 年4 月的一篇Molecular Plant 文章涉及到将拟时序分析和激素响应结合，可见此分析是一个比较好的突破点。
3、拓宽研究领域：目前发表的植物单细胞文章主要还是以构建细胞图谱为主，其他领域还少有涉及，因此将研究拓展到植物发育、育种、胁迫方向等领域，是植物单细胞研究的一个重要方向。
4、特定细胞群体分析：相信植物单细胞研究会和动物单细胞研究一样（特别是医学领域），早期的文章主要以细胞图谱为主，随着发表文章数量的增多和研究的深入，研究方向势必会向精细化方向发展，因此研究特定的细胞在生长发育、胁迫耐受等方向的特定功能是植物单细胞研究的必经之路。
5、特定基因的研究：此研究类似于动物研究中的体内、体外实验，通过对细胞中特定基因进行敲低、过表达操作，研究特定基因的具体分子功能。此研究方向中，单细胞测序的重要性会明显降低，仅仅是以基因功能研究的基础而存在，为功能基因的引入提供数据支撑。此研究方向是所有可选研究方向中的最高境界，如果可以开展，有望发表出顶级期刊。
尽管目前植物单细胞转录组研究尚处于起步阶段，但其发展十分迅猛，预计未来将会有更多植物的单细胞研究报道，这些研究解决的科学问题将从单一的构建单细胞图谱转变成在单细胞水平上解析发育、细胞行为和进化机制。
1. Ryu KH, et al. Plant Cell Identity in the Era of Single-Cell Transcriptomics. Annu Rev Genet. 2021 Nov 23;55:479-496.
2. Denyer T, et al. Crafting a blueprint for single-cell RNA sequencing. Trends Plant Sci. 2022 Jan;27(1):92-103.
3. Serrano-Ron L, et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNA sequencing reveals order of tissue initiation. Mol Plant. 2021 Aug 2;14(8):1362-1378.
4. Nelms B, et al. Defining the developmental program leading to meiosis in maize. Science. 2019 Apr 5;364(6435):52-56.
文末公告，联川出版社发布的《单细胞测序研究一本通3.0》已经正式上架销售，欢迎各位老师登陆微店“联川驿站”，或者扫描以下二维码购买新书！多种售书方案随心搭，还有32G U盘（内含海量单细胞学习资料）购完为止，快来抢购吧！
植物单细胞样本制备，你不知道的细节（文末有彩蛋） | 单细胞专题
几类经典场景下的单细胞分析套路，赶紧来围观！（文末有彩蛋）| 单细胞专题
所见即所得，绘图高规格联川云平台，让科研更自由